Polihistidin etiketi

Polihistidin etiketi genellikle proteinlerin N- veya C- sonunda bulunan, en az 6 histidin (His) amino asidinden meydana gelen bir amino asit motifi. Aynı zamanda hekza histidin etiketi, 6xHis etiketi, His6 etiketi ve marka ismiyle His etiketi (EMD Biosciences tarafından literatüre sokulmuştur) olarak bilinir. Etiket Roche tarafından icat edilmiş[1] olmasına rağmen Histidinlerin kullanımı ve vektörlerinin dağıtımı Qiagen tarafından gerçekleştirilir. Qiagen, Sigma, Thermo Scientific, GE Healthcare, Macherey-Nagel, Clontech, Bio-Rad ve diğer şirketler çeşitli histidin-etiketli protein saflaştırma kitlerini edinmeyi mümkün kılar. Etiketin bilimsel amaçlı kullanımı sınırsız iken ticari kullanıcılar Roche' ye telif hakkı ödemesi yapmak zorundadır. Orijinal patent 11 Şubat 2003' te sona erdi. Bundan dolayı şimdi kamu malı olarak ele alınmalıdır. Bazı etiket dizilerinin serbest ticari kullanımı serbesttir. Örneğin; MK(HQ)6 E. coli de güçlendirilmiş anlatımda ve etiket kaldırılmasında kullanılabilir. Etiketteki toplam His sayısı değişebilir. N- veya C-terminal his-etiketleri polihistidin etiketinin -endopeptidazlar tarafından- kaldırılmasını kolaylaştıracak müsait amino asit dizilerinin öncesinde veya sonrasında yer alabilir. Bu fazladan diziler His etiketi N-terminalden, ekzopeptidaz kullanımı ile, kaldırıldığında önem ifade etmezler. Bunun da ötesinde, endoproteaz temelli etiket kaldırılma yönteminin kullanımında spesifik olmayan kesimlere ortaya çıkar. Ekzopeptidazlar bu sorunun ortadan kalkmasına sağlayabilir. Polihistidin-etiketler genellikle genetik olarak değiştirilmiş olan proteinler ve afinite saflaştırması için tercih edilir.

Prensip
Ni(NTA)(H2O)2' nin(Nikel nitrilotriasetik asit kompleksi) yapısının 3 tane X ışını görüntüsü

Genelde, proteinler az ya da çok yüzeylerinde metal iyonlarını koordine edebilme yeteneğine sahiptir ve bu koordinasyonun afinitesindeki farklılık kullanılarak kromatografi ile proteinleri birbirinden ayırmak mümkündür. Bu sabitlenmiş metal iyon afinite kromatografisi 1975' te ilan edilmiştir.[2] Hemen ardına yapılan çalışmalar proteinleri oluşturan amino asitler arasında histidinin metal iyonları ile güçlü bağlar kurabildiği anlaşıldı.[3] Yani, genetik mühendisliği ile proteinin sonuna birkaç histidin eklenirse proteinin metal iyonlarına karşı afinitesi kaile alınır biçimde yükselir ve bu afinite kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş hedef protein saflaştırılabilir, temel fikir budur. His etiketine sahip protein pH 8 veya daha bazik durumlarda yüzeye sabitlenmiş olan nikel gibi bir taşıyıcı ile etkileştiğinde, histidin metal iyonları ile etkileşir ve taşıyıcıya bağlanır. Diğer proteinler ya bağlanmayıp ya da çok zayıf bir şekilde bağlandığından taşıyıcı uygun tampon çözelti ile yıkandığında bunlardan kurtulunmuş olunur. Sonra ise imidazol veya benzeri madde taşıyıcıdan ayırarak proteinleri yüksek saflıkta elde etmek mümkündür.

Taşıyıcı

Ni - NTA (nikel - nitrilotriasetik asit) gibi çeşitli ürünler piyasada mevcuttur. Kolonun içinde paketlidir ve santrifüj ve bir test tübünde manyetik ayrım ile kombine edilebilir.

Metal iyonları

Mtal iyonlarının afiniteleri bakır, nikel çinko ve kobalt sırasınca azalır. Nikel genel amaçlar için sıkça tercih edilirken kobalt ise saflaştırmanın saflığı azaltılmak istendiğinde tercih edilir.

Eleme metodu

Taşıyıcıdan His etiketli proteini ayrımak için birçok metot vardır ve amaca göre seçim yapılabilir. Proteinlerin denturasyonundan kaçınmak için imidazol kullanımı iyi bir seçenek olarak ele alınır.

Analoglar ile rekabet

Bir bileşik hisitidine benzer bir yapıya sahipse ve ortamda bolca mevcutsa proteinler ile arasında metal iyonlarına bağlanmak için bir rekabet oluşur. ve proteinler taşıyıcıdan ayrılır. Bu kimyasallardan biri imidazoldur. İmidazol histidinin yan zincirini oluşturan bileşiktir. Genelde 150mM veya daha fazla konsantrasyonda kullanılır. Bazı koşullarda ise histidin (proteinin yapısından bağımsız bir şekilde yalnız amino asit olarak) veya histamin aynı amaçla kullanılabilir.

pH' de düşüş

pH düştüğünde histidin protonlanır ve taşıyıcıdan ayrılır çünkü metal iyonu ile artık koordine olamaz.

Metal iyonlarından ayırma

Güçlü bir şelator ajanı eklendiğinde, protein taşıyıcıdan düşer çünkü taşıyıcıdaki sabitlenmiş metal iyonları kaybedilir. Bu amaçla EDTA bir hayli yaygın kullanılır.

Uygulamalar

Protein saflaştırma

Polihistidin-etiketleri sıklıkla E. Coli' de, ve diğer prokaryotik anlatım sistemlerinde, anlatımı gerçekleştirilmiş polihistidin-etiketli rekombinant proteinlerin afinite saflaştırması için kullanılır.[4] Bakteri hücreleri santrifüj edilir ve elde edilen hücre peletleri ya fiziksel ya da detejanlar ve enzimler(lizozim gibi) veya bunların kombinasyonu ile lize edilir. Bu adımda lizat rekombinant proteinlerin yanında aynı zamanda bakteriyal hosttan gelen proteinleri de içerir. Karışım divalent nikel veya kobalt iyonlarının bağlı olarak bulunduğu afinite rezininde bekletilir. Afinite rezininin farklı çeşitleri ticari olarak mevcuttur. Nikel ve kobalt benzer özelliklere sahiptir, ikisi de 4. periyod geçiş metallerine komşudur. Rezin genelde sefaroz/agarozdur. Rezin bir şelator (Nikel için iminodiasetik asit (Ni-IDA) ve nitrilotriasetik asit (Ni-NTA), kobalt için ise karboksilmetilaspartat (Co-CMA)) ile işlev kazanır. Şelator polihistidin-etikete mikromolar afinite ile bağlanır. Ardından nikel veya kobalta sipesifik olarak bağlanmamış olan proteinleri kaldırmak amaçlı rezin fosfat tamponu yıkanır. Nikel temelli yöntemlerde, yıkamanın verimini arttırmak amacı ile tampona 20 mM imidazol (genelde 150-300 mM imidazolde proteinler elenmiş olur) ilave edilir. Genelde nikel kullanan rezinler daha yüksek bağlanma kapasitesine sahip olurken kobalt temelli rezinler yüksek saflık vadeder. Proteinin saflığı ve miktarı SDS-PAGE veya Western blot ile öğrenilebilir.

Polihistidin etiketi kullanılarak yapılan afinite saflaştırmaları, rekombinant protein prokaryot bir organizmadan elde edilmiş ise, saf protein eldesi ile sonuçlanır. Sonraki adımdaki yapılacak uygulamaya(protein ilişkilerinin çalışılması için protein komplekslerinin izolasyonu, mantar veya diğer yüksek ökaryot organizmalardan yapılacak saflaştırmalar gibi) göre değişmekle beraber -saflığı yükseltmek amaçlı iki etiket kullanan- ardışık afinite saflaştırmaya ihtiyaç duyulabilir.[5] Alternatif olarak, nikel iyonları yerine kobalt iyonları sabitlenmiş rezini kullanan tek-adımda saflaştırma yöntemi saflıkta önemli ölçüde yükselme sağlarken his-etiketli proteinlerin elenmesinde kullanılan imidazol miktarını da düşürür.

Polihistidin-etiketleme çalışma prensibi gereğince proteinlere sadece ve sadece birincil yapısına bağlı olarak etkir. Bundan dolayı denature edici koşullarda bulunan rekombinant proteinlerin saflaştırılması için bir seçenek haline gelir. Örneğin, yoğun bir biçimde bir içerme kesinde eksprese olan ve çözünür olarak elde edilemeyen rekombinant proteinler bile üre veya guanidin hidroklorür ile denaturasyon ile saflaştırılabilir. Bunun gibi denature edici durumlarda histidin bağlanması imidazol bağlanması yerine pH kullanılarak titre edilir. Yüksek pH' da histidin nikel veya kobalta bağlanabilirken düşük pH' da (kobalt için ~6, nikel ~4) bağlanma gerçekleşmeş çünkü histidin protone olur. GST saflaştırması ve antikor saflaştırılmasının uygulanması için proteinin katlanmış halde olmasını gerekir. Diğer yandan, His etiketi diğer etiketlere göre toplanmaya ve çözünürlüğünü kaybetmeye daha çok eğilimlidir.

Polihistidin-etiket sütunun bazı proteinleri safsızlık olarak barındırır. Bu safsızlıklardan biri yaklaşık 25kDa ağırlığındaki FKBP-tipi peptidil prolil izomerazdır(SlyD). Sıklıkla, safsızlıklardan kurtulmak için ya ikinci bir kromatografik teknik kullanılır veya rekombinant proteinin anlatımı SlyD- yoksunu bir E.koli sujunda gerçekleştirilir.[6] Başka bir çözüm ise kobalt rezinin SlyD' ye (E. coli) karşı afinitesinin daha düşük olması sebebi ile tercih edilmesidir, bazı durumlarda faydalı olduğu belirtilmiştir.[7]

Bir polihistidin etiketine sahip protein ile iki etikete sahip proteinin birbirinden ayrımı

Farklı sayıda polihistidin etiketine sahip proteinler nikel afinite rezininde farklı olarak elenirler. Bir hekzahistidin etiketine sahip proteinler 75 mM imidazol ile Ni-NTA rezinde elenirler. İki etikete sahip olanlar ise elenmek için 100 mM imidazole ihtiyaç duyar. Bu adım adım eleme spesifik bir karışımdan protein parçalarının izolasyonunda kullanılabilir. Mesela tanımlanmış heteromultimerler (AA ve BB homodimerlerini içeren bir karışımdan ,eğer sadece B polihistidin etiketine sahip ise, AB heterodimerinin izolesi gibi). bu şekilde izole edilebilir. Benzeri bir yaklaşım monovalent streptavidin izolasyonunda da kullanılır.[8]

Bağlanma tahlili

Polihistidin-etiketleme, çekme-itme tahlili ile aynı biçimde protein-protein etkileşimlerini belirlemek için kullanılabilir. Ancak bu teknik-bu iş için- daha az hassas olarak ele alınır ve fazlaca titizlik isteyen bölümlerinden dolayı kullanıcıyı sınırlar. Örneğin; indirgen koşullar kullanılamaz, bu da EDTA ve birçok çeşit deterjanın kullanımının mümkün olmadığı anlamına gelir. Dual polarizasyon interferometrisindeki yeni gelişmeler EDTA ve birçok kimyasalın kullanımın bu yöntemde kullanımının yolunu açtı ve böyle taraf-spesifik etiketlerin kullanımı konformasyonal değişim ile ilişkili direkt ölçümleri büyük oranda kolaylaştırdı.

Floresan etiketler

Hekzahistadin CyDye etiketleri geliştirilmiştir. Bunlar floroforlara bağlı EDTA ile ile kovalent koordinasyonda olan nikeli kullanır, polihistidin-etiket bağlandığında boyanma gerçekleşir. Bu tekniğin protein trafiğini ve göçünü takipte etkili olduğu açıklanmıştır. Yeni gelişmeler bu tekniğin Floresans Rezonans Enerji Transferi yardımı ile uzaklık ölçümünde etkili olabileceğini gösterdi.[9]

Florohistidin etiketler

Poliflorohistidin etiket in vitro translasyon sistemlerinde kullanım için raporlanmıştır.[10] Bu sistemde, bir genişletilmiş genetik kod kullanılır. Bu kodda histidin yerine 4-florohistidin kullanılır. Florlanmış analog, histidin-tRNA ligazın gevşemiş subsrat spesifitesi ile, peptitlere dahil olur ve etiketin toplam pKa değerinin düşmesine sebep olur. Bu durum poliflorohistidin etiketli peptidlerin -geleneksel polihistidin etiketlerinin komplex karışımı varlığında- yıkama tamponlarının pH' ı değiştirilerek seçici zenginleştirilmesine izin verir.

Polihistidin-etiketlerin eklenmesi
Polihistidin-etiketlerin eklenmesi. (A) İlgili proteini üreten DNA C-terminusuna His etiketi kaynamış vektöre eklenir.Bu durumda His etiketi ile ilgili proteini kodlayan DNA komşu olmuş olur ve birlikte transkribe olur. (B) His etiketi ekli primerler ile yapılacak olan PCR reaksiyonu sonucunda genin N- terminusuna ekli His-etiketleri elde edilmiş olur.

En yaygın polihistidin etiketler 6 histidinden ibarettir. Metiyonini takip edecek şekilde ilgili proteini kodlayan genin N-terminusuna eklenir ve hemen durma kodonundan önce sona erer. His etiketinin hangi terminusa ekleneceği temel olarak proteinin karakteristiğine ve etiketi kaldırmada kullanılacak olan metoda bağlıdır. Bazı uçlar proteinin hidrofobik çekirdeğine gömülüdür ve bu gömülü kısımlar proteinin işlevselliği veya yapısı için önem ifade eder. Bu durmlarda seçenekler sadece diğer uç ile sınırlıdır. Buna ilave olarak çoğu ekzopeptidazlar sadece N ucundan etiket kaldırabilir. C ucundan etiket kaldırmak ise başka metodlar gerektirir. Yöntem seçiminde bilgisayar simulasyonlarını(moleküler dinamik ile) hesaba katmak seçenekler arasında seçim yapmak için önemlidir. Örneğin; His etiketi sindirilmek zorunda mı yoksa N- veya C ucuna göre modifiye mi edilmeli ikileminde bilgisayar simulasyonları seçim konusunda yardımcı olabilir.[11]

Polihistidinleri eklemenin iki yolu vardır. En kolayı proteini kodlayan DNA parçasını His etiketi kodlayan vektöre entegre etmektir. Diğer seçenek ise başlama kodonuna veya durma kodonuna yanına tekrar eden histidin kodlayan kodonlar (CAT veya CAC) barındıran primerler ile PCR yapmaktır.

PCR kullanarak 6xHis etiketi eklemek için hazırlannmış primer örneği. 6 adet histidini kodlayan 18 baz başalama veya durma kodonlarının hemen yanına eklenir. His etiketine bitişik halde ilgili gene spesifik en az 16 baza ihtiyaç vardır. 6 his etiketi ile proteine 1kDa moleküler ağırlık eklenmiş olur. Not: Genelde protein ve His etiketi arasına bir bağlayıcı (gly-gly-gly veya gly-ser-gly gibi) konur. Bu bağlayıcı ile His etiketinin etiketli proteinin aktivitesini etkilemesi engellemniş olur.

Tanılama

Polihistidin etiketi ,anti-polihistidin-etiketli antikorları kullanımı veya alternatif olarak metal iyonları taşıyan floresan problar ile jelde boyama(SDS-PAGE) ile proteinleri tanılamak için kullanılabilir. Bu hücrealtı lokalizasyonda, ELISA, Western blot ve diğer immüno-analitik metodlarda kullanışlı olabilir.

Sabitleme

Polihistidin etiketi proteinlerin bir yüzeye sabitlenmesinde başarılı biçimde kullanılabilir. Bu yüzey nikel veya kobalt kaplı mikrotiter tabak veya bir protein sırası(array) olabilir.

Benzer etiketler

HQ etiketi

Histidin ve glutamin birbirine alternatif olabilen etiketlerdir (HQHQHQ).

HN etiketi

Histidine and asparajin birbirine değişerek devam ettiği peptid etiketleri (HNHNHNHNHNHN) mevcuttur ve proteinin yüzeyinde bulunması His etiketinde bulunmasından daha olağandır. Sabitlenmiş metal iyonlarına His etiketinden daha verimli bağlanır.[12]

HAT etiketi

Bu peptit etiketi (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK) tavuk laktat dehidrogenazdan türetilmiştir. His etiketi yük dağılımında sapma gösterirken bu etiket bu tür bir davranız sergilemez ve suda çözünür bir protein olma eğilimindedir.[13] Histidinin düzeni His etiketinden olduğundan daha sterik hale gelir ve sabitlenmiş metal iyonuna daha verimli bağlanır.

Ayrıca bakınız
  • Protein etiketi

Kaynakça
  1. Hochuli, E.; Bannwarth, W.; Döbeli, H.; Gentz, R.; Stüber, D. (1988). "Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent". Bio/Technology. 6 (11). s. 13215. doi:10.1038/nbt1188-1321. Şablon:INIST.
  2. Porath, J.; ve diğerleri. (1975). "Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation". Nature. 258 (5536). ss. 598-599. doi:10.1038/258598a0. PMID 1678.
  3. Porath, J. (1992). "Immobilized metal ion affinity chromatography". Protein Expr. Purif. 3 (4). ss. 263-281. doi:10.1016/1046-5928(92)90001-D. PMID 1422221.
  4. Hengen, Paul N (1995). "Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli". Trends in Biochemical Sciences. 20 (7). ss. 285-6. doi:10.1016/S0968-0004(00)89045-3. PMID 7667882.
  5. Gavin, Anne-Claude; Bösche, Markus; Krause, Roland; Grandi, Paola; Marzioch, Martina; Bauer, Andreas; Schultz, Jörg; Rick, Jens M.; Michon, Anne-Marie; Cruciat, Cristina-Maria; Remor, Marita; Höfert, Christian; Schelder, Malgorzata; Brajenovic, Miro; Ruffner, Heinz; Merino, Alejandro; Klein, Karin; Hudak, Manuela; Dickson, David; Rudi, Tatjana; Gnau, Volker; Bauch, Angela; Bastuck, Sonja; Huhse, Bettina; Leutwein, Christina; Heurtier, Marie-Anne; Copley, Richard R.; Edelmann, Angela; Querfurth, Erich; Rybin, Vladimir (2002). "Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes". Nature. 415 (6868). ss. 141-7. Bibcode:2002Natur.415..141G. doi:10.1038/415141a. PMID 11805826.
  6. Andersen, Kasper R.; Leksa, Nina C.; Schwartz, Thomas U. (2013). "Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification". Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 81 (11). ss. 1857-61. doi:10.1002/prot.24364. PMC 4086167 $2. PMID 23852738.
  7. Chen, Xuguang; Nomani, Alireza; Patel, Niket; Hatefi, Arash (2017). "Production of low-expressing recombinant cationic biopolymers with high purity". Protein Expression and Purification. Cilt 134. ss. 11-17. doi:10.1016/j.pep.2017.03.012. PMC 5479735 $2. PMID 28315745.
  8. Howarth, Mark; Chinnapen, Daniel J-F; Gerrow, Kimberly; Dorrestein, Pieter C; Grandy, Melanie R; Kelleher, Neil L; El-Husseini, Alaa; Ting, Alice Y (2006). "A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site". Nature Methods. 3 (4). ss. 267-73. doi:10.1038/nmeth861. PMC 2576293 $2. PMID 16554831.
  9. Zhao, Chunxia; Hellman, Lance M.; Zhan, Xin; Bowman, Willis S.; Whiteheart, Sidney W.; Fried, Michael G. (2010). "Hexahistidine-tag-specific optical probes for analyses of proteins and their interactions". Analytical Biochemistry. 399 (2). ss. 237-45. doi:10.1016/j.ab.2009.12.028. PMC 2832190 $2. PMID 20036207.
  10. Ring, Christine M.; Iqbal, Emil S.; Hacker, David E.; Hartman, Matthew C. T.; Cropp, T. Ashton (31 Mayıs 2017). "Genetic incorporation of 4-fluorohistidine into peptides enables selective affinity purification". Organic & Biomolecular Chemistry (İngilizce). 15 (21). ss. 4536-4539. doi:10.1039/C7OB00844A. ISSN 1477-0539. 25 Temmuz 2018 tarihinde kaynağından arşivlendi. Erişim tarihi: 25 Temmuz 2018.
  11. Mendoza-Llerenas, Edgar Omar; Pérez, David Javier; Gómez-Sandoval, Zeferino; Escalante-Minakata, Pilar; Ibarra-Junquera, Vrani; Razo-Hernández, Rodrigo Said; Capozzi, Vittorio; Russo, Pasquale; Spano, Giuseppe; Fiocco, Daniela; Osuna-Castro, Juan Alberto; Moreno, Abel (2016). "Lactobacillus plantarum WCFS1 β-Fructosidase: Evidence for an Open Funnel-Like Channel Through the Catalytic Domain with Importance for the Substrate Selectivity". Applied Biochemistry and Biotechnology. 180 (6). ss. 1056-1075. doi:10.1007/s12010-016-2152-2. PMID 27295039.
  12. U.S. Patent 7.176.298
  13. Cħaga, G.; ve diğerleri. (1999). "Natural poly-histidine affinity tag for purification of recombinant proteins on cobalt(II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose". J. Chromatogr. A. 864 (2). ss. 247-256. doi:10.1016/S0021-9673(99)01008-0.

Dış bağlantılar
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.